日本下药强伦姧人妻免费,少妇被黑人入侵在线观看,色婷婷视频国产一区视频,337p日本欧洲亚洲精品

上海喆圖科學(xué)儀器

Zhetu Scientific Instrument

服務(wù)熱線:400-001-0304

技術(shù)文章

ARTICLE

當(dāng)前位置:首頁技術(shù)文章慢病毒包裝詳細(xì)過程

慢病毒包裝詳細(xì)過程

更新時(shí)間:2024-03-14點(diǎn)擊次數(shù):1186

一、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

1、健康的HEK 293T細(xì)胞,一般使用復(fù)蘇后10代以內(nèi)的細(xì)胞進(jìn)行慢病毒的生產(chǎn),要求無細(xì)菌、真菌以及支原體污染;

2、轉(zhuǎn)染試劑,如PEI、Higene、lipo2000lipo3000

各種轉(zhuǎn)染試劑的步驟稍有差別,小助手以PEI為轉(zhuǎn)染試劑。

3DMEM無血清無雙抗培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基(10%FBS1%P/S);

4、10mL無菌注射器(環(huán)氧乙烷滅菌處理)

5、0.45μm的細(xì)菌濾器。

二、包裝步驟

Day1

7:00 PM)鋪板HEK 293T細(xì)胞

數(shù)量:400/10 cm dish ;覺得計(jì)數(shù)麻煩的話,可以在293T細(xì)胞長(zhǎng)到約90%匯合時(shí),1:5傳代(均分成5份),每1份的數(shù)目差不多就是400萬了。

Day2

3:00 PM)三質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

在培養(yǎng)箱中恢復(fù)細(xì)胞狀態(tài)約20h,此時(shí)可進(jìn)行轉(zhuǎn)染。三質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染體系三種質(zhì)粒的配比有許多種方式,目前MDL使用4:3:1的比例,即PxpAx2PMD2gPLVX(載有你基因的質(zhì)粒)10cm dish一般轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的總質(zhì)量為20μg,PEI的量為質(zhì)粒的2.5-3倍(也就是50μg-60μg,一般推薦按照2.5倍來)。按照比例算下來,PxpAx2PMD2gPLVX的質(zhì)量比為:(10ug:7.5ug:2.5ug)

注意:在提到質(zhì)粒的量時(shí),千萬記得說質(zhì)量而不是濃度,不然容易出錯(cuò)。

實(shí)驗(yàn)步驟:

取如上總質(zhì)量為20μg的質(zhì)粒添加到總體積500μLDMEM無血清無雙抗培養(yǎng)基中,記為A液,移液槍混勻20次;

PEI(一般配置成1μg/mL)50-60μg(也就是50-60μL)添加到總體積500μLDMEM無血清無雙抗培養(yǎng)基中,記為B液,移液槍混勻20次;

B液逐滴滴加到A液中,移液槍輕柔混勻66次,室溫靜置15-20min;

將靜置好的轉(zhuǎn)染試劑(A+B)緩緩滴加到恢復(fù)狀態(tài)20hHEK 293T細(xì)胞中。

做好標(biāo)記,記好轉(zhuǎn)染時(shí)間、轉(zhuǎn)染質(zhì)粒、換液時(shí)間等參數(shù)提高實(shí)驗(yàn)重復(fù)性。

Day3

9:00 AM)換液

轉(zhuǎn)染后的第18h,將含有轉(zhuǎn)染試劑的HEK 293T上清更換為10mL DMEM培養(yǎng)基;對(duì)于新手,為了防止在換液時(shí)將細(xì)胞吹散,可以留3mL的液體在dish中,更換8mL DMEM培養(yǎng)基。

Day4

3:00 PM)收集病毒液

在轉(zhuǎn)染后的48-72h,為病毒生產(chǎn)的高峰期,一般我們收集轉(zhuǎn)染后48h(換液后30h,產(chǎn)毒30h)的病毒液用于實(shí)驗(yàn),足以滿足大部分實(shí)驗(yàn)需求。收集病毒于15mL tube中,500g5mL離心去細(xì)胞碎片和雜質(zhì),隨后使用注射器和濾器進(jìn)行過濾。收集后的病毒上清可以用來進(jìn)行感染和儲(chǔ)存。

三、慢病毒滴度測(cè)定

病毒滴度的單位為:TU/mL,代表每毫升病毒液中具有轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的病毒顆粒的數(shù)目。

計(jì)算公式為:滴度=(感染時(shí)細(xì)胞數(shù)(個(gè))*陽性細(xì)胞%/病毒液體積(mL

病毒液體積和感染時(shí)細(xì)胞數(shù)已知,需通過流式細(xì)胞術(shù)確認(rèn)陽性細(xì)胞百分比。

滴度測(cè)定常常使用HEK 293T細(xì)胞,大致的原理為,將在DAY3收集到的病毒上清,按照梯度添加到293T細(xì)胞中,感染后48h檢測(cè)陽性細(xì)胞的比例,從而確定病毒的滴度。

四、注意事項(xiàng)

293T細(xì)胞的代數(shù)最好用15代以內(nèi),最多不超過20代,否則影響轉(zhuǎn)染效率。質(zhì)粒濃度在400-1000ng/μL范圍,純度260/2801.8-2.0之間的轉(zhuǎn)染效率較高?;旌象w輕輕滴入細(xì)胞上清后搖勻,動(dòng)作要輕,293T細(xì)胞貼壁不牢避免細(xì)胞脫落。





返回列表
  • 服務(wù)熱線 400-001-0304
  • 電子郵箱

    zhushumin@zhetu.com

掃碼加微信

Copyright © 2025 上海喆圖科學(xué)儀器有限公司版權(quán)所有    備案號(hào):滬ICP備14016230號(hào)-3

技術(shù)支持:化工儀器網(wǎng)    sitemap.xml

女人被添全过程a片试看v| 校花内裤被涂满了强烈春药| 亚洲欧洲无码av电影在线观看| 好大好湿好硬顶到了好爽| 欧美国产高清欧美内衣办| 国产精品爆乳尤物99精品| 护士被两个病人伦奷日出白浆| 99久久99久久免费精品| 初次尝了销魂少妇邻居| 高清中文字幕在线a片| 强壮公让我夜夜高潮a片视频| 嫩草院一区二区乱码| 国产强被迫伦姧在线观看无码| 邻居少妇太爽了a片在线观看动漫| 国产剧情av麻豆香蕉精品| 丰满少妇被粗大猛烈进人高清| 日韩AV无码一区二区三区| 人妻少妇久久久久久97人妻| 老根嫩草1一40淑媛全文| 中国熟女仑乱HD| 欧美熟妇丰满肥白大屁股免费视频 | 暴躁老外玩minecraft| 亲嘴伸进内衣揉胸口激烈视频| 高潮久久久久久久久不卡| 人人澡超碰碰97碰碰碰| 小sao货的yin荡之路| 青丝影院高清版在线观看| 国产JJIZZ女人多水免费| 久爱WWW人成免费网站下载| 永久免费AV无码国产网站18禁| 最新AV偷拍AV偷窥AV网站| 激烈 痉挛 抽搐 潮喷 mp4| 国产在线国偷精品产拍| 肉岳疯狂69式激情的高潮| 少妇被大黑捧猛烈进出动态图| 汽车上开两个的花苞| 黑人玩弄漂亮少妇高潮大叫| 最近中文字幕免费完整影视| 国产香蕉尹人视频在线| free性满足videoshd| 狼群西瓜视频在线观看|